Đặt vấn đề
Lan Hoàng thảo U lồi (Dendrobium wardianum) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là loài lan rừng đẹp, có mùi hương rất thơm, có giá trị y học và thương mại cao. Trên thế giới, lan Hoàng thảo U lồi có nhiều ở Ấn Độ, Butan, Trung Quốc, Myanman, Thái Lan. Ở Việt Nam, chúngphân bố chủ yếu tại Lào Cai (Sa Pa), Ninh Bình (Cúc Phương)… Lan Hoàng thảo U lồi chủ yếu sống phụ sinh trên thân, cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm, mọc ở độ cao 200-1200 m.
Lan Hoàng thảo U lồi có tác dụng chống ôxy hóa và chống tế bào ung thư ở người (các dòng tế bào khối u HL-60, A-549, SMMC-7721, MCF-7 và SW-480) với IC50 2,33-38,48 μM…
Những năm gần đây, do nạn phá rừng và tình trạng khai thác một cách tận diệt, mặt khác khả năng nảy mầm trong môi trường sống tự nhiên rất thấp vì hạt lan không chứa nội nhũ, cần phải cộng sinh của một số loại nấm thuộc chi Rhizoctonia mới nảy mầm được, nên loài lan Hoàng thảo U lồi có nguy cơ tuyệt chủng và được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam. Nhân giống lan Hoàng thảo bằng phương pháp truyền thống (tách chồi, cắt đoạn thân…) mất nhiều thời gian và không hiệu quả. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro là phương pháp được sử dụng nhiều trong nhân giống nhiều loại lan quý hiếm thuộc chi lan Hoàng thảo, tạo ra được một số lượng cây giống lớn có chất lượng cao, sạch bệnh trong thời gian ngắn và chi phí thấp. Đây là biện pháp góp phần bảo vệ, phát triển nguồn gen của loài thực vật quý hiếm này.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu:
Mẫu lan Hoàng thảo U lồi (Dendrobium wardianum) được thu thập ở Vườn quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Quả lan sau khi thụ phấn được 10 tháng sử dụng để làm vật liệu nuôi cấy khởi đầu.
Phương pháp nghiên cứu:
Khử trùng mẫu và nảy mầm hạt: Quả lan sau khi thu hái được rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy và ngâm trong dung dịch presept 0,5% trong 10 phút, sau đó rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng, cuối cùng ngâm trong dung dịch javel 30% trong 10 phút và rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng. Hạt được tách ra và gieo trên môi trường cơ bản VW (Vacin & Went), MS (Murashige & Shoog) và RE (Robert Ernst) có bổ sung 20 g/l sucrose, 6 g/l agar, 100 ml/l nước dừa + 2 mg/l Benzylaminopurine (BAP). Tỷ lệ hạt nảy mầm (%), thời gian xuất hiện protocorm (ngày) được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy.
Nhân nhanh protocorm: Protocorm được tách thành từng khối có đường kính khoảng 0,5×0,5 cm được cấy chuyển qua môi trường MS + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar + 100 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính bổ sung 2 mg/l BAP + 0-2 mg/l Indole-3-butyric acid (IBA); 2 mg/l BAP + 1 mg/l IBA + 0-50 g/l dịch chuối nghiền để khảo sát khả năng nhân nhanh protocorm. Hệ số nhân protocorm (lần) và đặc điểm hình thái của protocorm được đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy.
Tái sinh chồi từ protocorm: Protocorm được cấy vào môi trường MS + 20 g/1 sucrose + 6 g/1 agar + 100 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính, bổ sung 0-2,0 mg/l Kinetin (KIN); 1,5 mg/1 KIN + 0-50 g/l cà rốt nghiền để thăm dò khả năng tạo chồi. Số chồi/mẫu (chồi), chiều cao chồi (cm), số lá/chồi (lá) và chất lượng chồi được đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy.
Tạo rễ từ chồi in vitro: Các chồi in vitro có chiều cao 2-3 cm, 2-3 lá, chồi khỏe chưa có rễ được tách ra và cấy sang môi trường ra rễ có bổ sung 0-2,0 mg/l α-naphtalene acetic acid (αNAA), 20 g/1 sucrose, 6,0 g/1 agar, 100 ml/l nước dừa, 1 g/l than hoạt tính, 30 g/l dịch cà rốt nghiền để khảo sát khả năng hình thành rễ. Chiều cao cây (cm), số lá (lá), số rễ (rễ), chiều dài rễ (cm) và chất lượng rễ được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy.
Đưa cây in vitro ra vườn ươm: Các cây con in vitro có chiều cao 5-6 cm, 3-5 rễ và 3-4 lá. Cây con được rửa hết agar, rải đều trên khay sạch để trong 1 giờ, sau đó trồng vào chậu đất nung kích thước 12×10 cm trên các giá thể: rêu rừng, đá bọt núi lửa, xơ dừa (tỷ lệ 30:30:40), sau khi cây trồng được 2 tuần phun phân bón lá Growmore (30:10:10) liều lượng 1 g/l/lần/tuần, để khảo sát khả năng sinh trưởng của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm. Các chỉ tiêu theo dõi tỷ lệ sống (%), chiều cao cây (cm), số lá (lá), số rễ mới xuất hiện (rễ) và chất lượng cây được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy.
Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm Excel 2010 để hệ thống hoá các thông tin, số liệu phục vụ phân tích, đánh giá. Các số liệu được xử lý và phân tích thống kê bằng phần mềm IRRISTAT5.0.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện: Tháng 1/2022-10/2022.
Địa điểm: Trung tâm Ươm tạo Công nghệ và Doanh nghiệp Khoa học Công nghệ, Viện Ứng dụng Công nghệ.
Điều kiện nuôi cấy in vitro: Nhiệt độ phòng 25±2°C, ẩm độ 65-70%, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2.000-2.500 lux.
Kết quả và bàn luận
Tạo vật liệu khởi đầu
Ảnh hưởng của môi trường khoáng VW, MS, RE khác nhau đến khả năng nảy mầm của hạt được trình bày ở bảng 1.
Kết quả bảng 1 cho thấy, sau 6 tuần nuôi cấy tỷ lệ hạt nảy mầm và thời gian xuất hiện protocorm của lan Hoàng thảo U lồi trên môi trường khoáng khác nhau là không giống nhau. Trên nền môi trường MS, tỷ lệ nảy mầm của hạt lan là cao nhất (đạt 100%) và thời gian xuất hiện protocorm ngắn nhất (chỉ 4 tuần); tỷ lệ hạt nảy mầm nền môi trường VW (đạt 95%), thời gian xuất hiện protocorm ở mức trung bình (5 tuần). Nền môi trường RE cho tỷ lệ nảy mầm của hạt khá thấp (86%) và thời gian xuất hiện protocormdài hơn so với 2 nền môi trường trên (6 tuần). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của S.M. Abbaszadeh và cs (2018) là sử dụng môi trường MS thích hợp thì tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt 94% với lan Phalaenopsis ‘Bahia Blanca’ và95,27% với lan D. hookerianum.
Nhân nhanh protocorm
Ảnh hưởng của BAP + IBA đến khả năng nhân nhanh protocorm được trình bày ở bảng 2.
Kết quả ở bảng 2 cho thấy, sự kết hợp giữa BAP + IBA có ảnh hưởng hiệu quảđến khả năng hình thành protocorm. Ở nồng độ 1 mg/l IBA kết hợp với 2 mg/l BAP cho hệ số nhân protocorm cao nhất đạt 10,3 protocorm (lần), protocorm xanh và khỏe. Khi tăng nồng độ IBA lên 1,5-2 mg/l hệ số nhân protocorm giảm dần, thậm chí còn thấp hơn so với đối chứng, protocorm gầy, có hiện tượng màu vàng và chết. Nguyên nhân do IBA ở nồng độ cao làm ức chế khả năng phát sinh protocorm, kìm hãm sự phát triển của khối protocorm. Do vậy, có thể kết luận rằng nồng độ 1 mg/l IBA kết hợp với 2 mg/l BAP thích hợp cho quá trình tạo protocormcủa cây lan Hoàng thảo U lồi.
Ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến khả năng nhân nhanh protocorm
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, việc bổ sung các hợp chất hữu cơ tự nhiên vào môi trường sẽ có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. Theo Y. Hasanah và cs (2020), trong quả chuối có chứa một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên như: IAA, gibberellin, cytokinin, sắt; kali, vitamin B6, B12, trypthophan thúc đẩy protocormtăngtrưởng. Để tìm hiểu ảnh hưởng của dịch nghiền chuối đến quá trình nhân nhanh protocorm, chúng tôi tiến hành bổ sung dịch nghiền chuối với các hàm lượng khác nhau vào môi trường nuôi cấy (bảng 3).
Kết quả từ bảng 3 cho thấy, dịch nghiền chuối có tác dụng hiệu quả với quá trình nhân nhanh protocorm. Bổ sung dịch nghiền chuối hàm lượng 40 g/l cho hệ số nhânprotocorm đạt cao nhất 18,8 protocorm (lần), trong khi đối chứng môi trường không bổ sung dịch nghiền chuối chỉ đạt 10,2 protocorm (lần). Theo nghiên cứu của M.O. Islam và cs (2016), khi bổ sung 100 m/l dịch chiết chuối vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự hình thành và phát triển chồi từ protocorm với lan Dendrobium sp.. Bổ sung dịch chiết chuối 10 g/l vào môi trường VW cho hệ số nhân protocorm đạt cao nhất đối với lan Phalaenopsis amboinensis, khả năng hình thành protocorm tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 50 g/l dịch chuối với lan Cymbidium pendulum. Kết quả của chúng tôi đã phản ánh sự sai khác so với các nghiên cứu trước, có thể do giống và trên nền môi trường nuôi cấy khác nhau. Như vậy, hàm lượng dịch nghiền chuối 40 g/l thích hợp cho việc nhân protocormlan Hoàng thảo U lồi.
Tái sinh chồi từ protocorm
Ảnh hưởng của KIN đến khả năng tái sinh chồi từ protocorm được trình bày ở bảng 4.
Kết quả ở bảng 4 cho thấy, bổ sung KIN nồng độ 0-1,5 mg/l thì sự hình thành chồi và sinh trưởng của chồi cũng tăng lên. Ở nồng độ 1,5 mg/l KIN khả năng tái sinh chồi từ protocorm đạt cao nhất: số chồi/mẫu là 12,5 chồi, chiều cao chồi đạt 1,36 cm, số lá đạt 2,6 lá. Tuy nhiên, khi nồng độ KIN tăng lên 2 mg/l thì sự hình thành chồi và sinh trưởng chồi giảm xuống, chồi có biểu hiện biến dị, nhỏ và vàng, có thể giải thích KIN ở nồng độ cao ức chế protocorms phát triển thành chồi cây. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của T.Q. Dan và cs (2018) trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l KIN thuận lợi nhất cho sự hình thành chồi và sinh trưởng của chồi lan Renanthera imschootiana Rolfe.
Ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt đến khả năng tái sinh chồi từ protocorm được trình bày ở bảng 5.
Kết quả ở bảng 5 cho thấy, dịch nghiền cà rốt đã ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng phát sinh chồi từ protocorm. Các hàm lượng dịch nghiền cà rốt khác nhau, sự phát sinh chồi từ protocorm cũng khác nhau, ở hàm lượng 30 g/l dịch nghiền cà rốt bổ sung vào môi trường cho kết quả tốt nhất, với số chồi 32,58 chồi/mẫu, chiều cao đạt 2,5 cm, số lá/chồi là 3,5 lá. Điều này có thể do trong dịch nghiền cà rốt giàu carbohydrate, Ca, P, Fe, Mg và cytokinin, vitamin, axit amin, sterol nội sinh có tác dụng tăng khả năng tái sinh chồi từ protocorm và sự sinh trưởng của chồi. Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng dịch nghiền cà rốt lên 40-50 g/l thì khả năng tái sinh chồi từ protocorm và sự sinh trưởng của chồi có xu hướng giảm dần. Khi hàm lượng dịch nghiền cà rốt trong môi trường nuôi cấy quá cao làm ức chế sự tái sinh của chồi, có thể do áp lực thẩm thấu của môi trường cao và ngăn chặn sự hấp thu nước và các chất cần thiết cho sự phát triển của chồi. Như vậy, hàm lượng dịch nghiền cà rốt 30 g/l thích hợp cho việc tái sinh chồi cũng như sinh trưởng phát triển của chồi, chồi to khỏe, lá to màu xanh đậm.
Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Ảnh hưởng của αNAA đến khả năng tạo rễ cây con in vitro được trình bày ở bảng 6.
Kết quả ở bảng 6 cho thấy, tất cả các công thức thí nghiệm đều hình thành rễ, điều này cho thấy cây lan Hoàng thảo U lồi là một loài lan dễ tái sinh rễ in vitro. Tuy nhiên, ở những môi trường khác nhau thì khả năng tạo rễ có sự khác nhau, môi trường bổ sung 1 mg/l αNAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy sau 6 tuần theo dõi cây đạt các chỉ tiêu sinh trưởng tốt nhất, chiều cao cây đạt 7,2 cm, số lá đạt 6,6 lá/cây, số rễ (10,8 rễ/cây), chiều dài rễ đạt 3,01 cm, rễ mập, dài, khỏe, màu trắng đục, chóp rễ xanh. Khi nồng độ αNAA tăng lên 1,5-2 mg/l thì giảm số lượng rễ tạo thành, rễ ngắn, nhỏ màu xanh nhạt, hiện tượng này có thể do nồng độ auxin tăng, làm ức chế quá trình ra rễ. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của L.T. Vinh và cs (2022) trên môi trường bổ sung 1 mg/l αNAA thuận lợi nhất cho sự ra rễ in vitro lan D. anosmum và cây Vanilla.
Đưa cây in vitro ra vườn ươm
Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây con in vitro được trình bày ở bảng 7.
Kết quả ở bảng 7 cho thấy, giá thể có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con ở giai đoạn vườn ươm. Trên giá thể rêu rừng, đá bọt núi lửa, xơ dừa, các chỉ tiêu tỷ lệ sống chỉ đạt 70,1-78,3%, cây nhỏ yếu, lá xanh nhạt, rễ mới hình thành ít. Cây trồng trên giá thể gồm rêu rừng, đá bọt núi lửa và xơ dừa (tỷ lệ 30:30:40) cho tỷ lệ sống cao nhất (96,6%), khả năng sinh trưởng cũng tốt nhất (chiều cao cây đạt 9,10cm với 3,8 rễ mới và 8,7 lá/cây), cây khỏe, thân cứng, rễ bám tốt vào giá thể và xuất hiện nhiều rễ mới, hỗn hợp giá thể này có độ thoáng khí, bộ rễ có thể hô hấp tốt đồng thời vẫn có khả năng giữ ẩm tốt, nâng cao hiệu quả ra cây. Như vậy, trên nền giá thể gồm rêu rừng, đá bọt núi lửa và xơ dừa (tỷ lệ 30:30:40) có độ thoáng và giữ ẩm thích hợp cho cây con thích nghi và sinh trưởng.
Kết luận
Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường nhân nhanhprotocorm tối ưu là MS bổ sung 2 mg/l BAP, 1 mg/l IBA, 40 g/l dịch nghiền chuối.
Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocormlà MS bổ sung1,5 mg/l KIN, 30 g/l dịch nghiền cà rốt.
Môi trường MS bổ sung 30 g/l dịch nghiền cà rốt, 1 mg/l αNAA thích hợp cho cây in vitro tạo rễ, với số rễ đạt được cao nhất là 10,8 rễ/cây.
Giá thể phù hợp nhất cho cây con ở giai đoạn vườn ươm là hỗn hợp rêu rừng, đá bọt núi lửa và xơ dừa (tỷ lệ 30:30:40) cho tỷ lệ cây con sống đạt (96,6%), cây to khỏe, lá xanh đậm, ra rễ mới nhiều, rễ xanh.
Theo Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt nam